Tecnologie di Validazione

La piattaforma di Validazione è dedicata alla validazione clinica e funzionale dei marcatori candidati e comprende le tecnologie di:

  • Morfologia molecolare
  • Biologia molecolare

Le piattaforme di validazione sono strumentali alla validazione clinica dei marcatori candidati. Infatti, il significato clinico-patologico dei geni e proteine selezionati dalle analisi microarray e proteomiche puo’ essere compreso solo studiandone la distribuzione nei tessuti neoplastici e normali con metodiche di morfologia molecolare, mentre il significato patogenetico può essere individuato interferendo con la sua funzione.

La validazione dei bersagli molecolari individuati dalla ricerca di base richiede pertanto l’applicazione di tecnologie di interferenza di funzione, di visualizzazione di molecole a livello tissutale, cellulare e sub-cellulare preferibilmente ad elevata processività, lo sviluppo di nuovi reagenti (nuovi anticorpi e metodiche diinterferenza di funzione).

L’analisi di un elevato numero di tessuti normali e neoplastici per comprendere la rilevanza clinica di un marcatore implica un’enorme mole di campioni e lavoro, nonchè un forte consumo di reagenti. Questi problemi possono essere risolti utilizzando gli array tissutali, che consistono in un blocco singolo di paraffina ottenuto dall’assemblaggio di piccoli cilindri di frammenti di tessuto presi da inclusioni in paraffina di tessuto normale o neoplastico usati nella valutazione patologica di routine. In questo modo, gli studi di immunoistochimica di potenziali biomarcatori possono essere condotti in modo rapido ed economico utilizzando un singolo o un piccolo numero di supporti. Il presente progetto utilizzerà a pieno questa tecnologia applicata allo studio del cancro.

L’utilizzo degli array tissutali per la validazione di bersagli multipli permetterà un’analisi su ampia scala di proteine potenzialmente interessanti attraverso l’utilizzo dell’immunoistochimica e la valutazione dello status del gene relativo (numero di copie e/o eventuale amplificazione) mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH).

L’immunoistochimica utilizza anticorpi monoclonali come sonde con immuno-coloratori automatici e sistemi di rilevazione ad elevata sensibilità e consente di valutare l’espressione proteica nei campioni in esame, caratterizzandone il pattern di reattività, la localizzazione intracellulare, l’intensità e l’eterogeneità usando un sistema a punteggi quantitativi e semi­quantitativi. E’ inoltre possibile analizzare la co-localizzazione di specifici marcatori mediante tecnologia a immunofluorescenza con sonde multiple, marcate con adatti fluorocromi, anche su Tissue MicroArrays (TMA) utilizzando microscopi motorizzati e software dedicati. La tecnica FISH prevede l’utilizzo di sonde cromosoma-locus specifiche marcate con fluorocromi per evidenziare alterazioni cromosomiche quantitative o strutturali del DNA. L’ibrido sonda-bersaglio viene visualizzato mediante un microscopio a fluorescenza. Con queste tecniche è possibile eseguire analisi sia su singoli campioni che su TMA.

Nell’ambito di questa piattaforma si intende anche mettere nelle condizioni i ricercatori di accedere a tecnologie di “imaging” standard o ad elevata processività (sistema Aperio, microscopia a fluorescenza robotizzata, microscopia confocale).

E’ possibile effettuare lo studio dell’espressione genica su cellule e tessuti in tutti i casi in cui siano disponibili anticorpi specifici. Questa però non è la norma, e nella maggior parte dei casi è difficile reperire anticorpi diretti contro le molecole candidate. Intendiamo sfruttare le competenze presenti a Verona per sviluppare e mettere a punto nuovi anticorpi specifici per i bersagli molecolari di interesse.  A tal fine verranno sviluppati anticorpi poli e monoclonali mediante l’utilizzo di librerie fagiche o presso ditte specializzate con la formula del servizio esterno.